ELISA試劑盒基本原理： 試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被相關(guān)指標(biāo)的抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的相關(guān)指標(biāo)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。 ELISA試劑盒試劑盒組成： 中文名稱 英文名稱 規(guī)格 保存 ELISA酶標(biāo)板（可拆卸） Micro ELISA Plate(Dismountable) 8×12 / 8×6 4℃/-20℃ 凍干標(biāo)準(zhǔn)品 Reference Standard 2/1 支 4℃/-20℃ 標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液 Reference Standard & Sample Diluent 1瓶20mL/12mL 4℃ 濃縮生物素化抗體 Concentrated Biotinylated Detection Ab 1支120μL/70μL 4℃/-20℃ 生物素化抗體稀釋液 Biotinytated Detection Ab Diluent 1瓶 10mL/6mL 4℃ 濃縮HRP酶結(jié)合物 Concentrated HRP Conjugate 1支120μL/70μL 4℃(避光) 酶結(jié)合物稀釋液 HRP Conjugate Diluent 1瓶 10mL/6mL 4℃ 濃縮洗滌液（25×） ConcentratedWashBuffer (25×) 1瓶 30mL/16mL 4℃ 底物溶液（TMB） Substrate Reagent 1瓶 10mL/6mL 4℃(避光) 反應(yīng)終止液 S Solution 1瓶 10mL/6mL 4℃ 封板覆膜 Plate Sealer 5/3 張 產(chǎn)品說明書 Product Description 1 份 質(zhì)檢報告 Certificate of Analysis 1 份 特別說明： [96T/48T]（打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全完整） 一周內(nèi)使用可存于4℃，需長時間存放或多次使用建議存于-20℃. ELISA試劑盒檢測準(zhǔn)備工作： 1. 請?zhí)?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。 2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正?，F(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過50℃，使用時洗滌液應(yīng)為室溫）。當(dāng)日使用。 3. 標(biāo)準(zhǔn)品: 于10000×g離心1分鐘，加入標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，旋緊管蓋，靜置10分鐘，上下顛倒數(shù)次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為8000pg/mL）。然后根據(jù)需要進(jìn)行倍比稀釋（注：不要直接在反應(yīng)孔中進(jìn)行倍比稀釋）。建議配制成以下濃度：按照稀釋方法圖例 標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液直接作為空白孔0ng/mL。如配制5ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5mL10ng/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5mL標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液的EP管中，混勻即可，其余濃度依此類推。 4. 生物素化抗體工作液：實驗計算當(dāng)次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應(yīng)多配制100-200μL。使用15分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作濃度。當(dāng)日使用。 5. 酶結(jié)合物工作液：實驗計算當(dāng)次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應(yīng)多配制100-200μL。使用15分鐘，以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結(jié)合物(1:100)成工作濃度。 當(dāng)日使用。 注意事項： A 仔細(xì)閱讀說明書。 B 檢查試劑盒標(biāo)簽上的有效期。如果超過有效期，請勿使用。 C 按說明書確定所有試劑齊全（數(shù)量、體積）。 D 標(biāo)本制備要規(guī)范，每份標(biāo)本體積要按2-3個復(fù)孔以上的量制備（貯存），盡量分裝做備份。短期內(nèi)無法實驗者，注意低溫保存。 E 準(zhǔn)備好所有實驗額外所需物品，（比如移液器，試管，清洗器，酶標(biāo)儀）。 F 按說明書將所用試劑平衡至室溫，根據(jù)檢測標(biāo)本數(shù)量確定所需試劑的量。 G 檢查試劑盒內(nèi)每種試劑的貯存條件，保證所有試劑均按照試劑盒內(nèi)說明書推薦的條件存儲。 H 檢查不穩(wěn)定或者變質(zhì)的試劑溶液（比如沉淀或變色）。有些試劑，比如標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液或者檢測稀釋液，可能在設(shè)計時就含有沉淀物。所有試劑在滴入酶標(biāo)板之，必需充分混勻。而由于沉淀物的特性，在加入酶標(biāo)板之，必需不停攪拌。 I 保證充分的孵育時間和溫度。 J 切勿使用不同生產(chǎn)批號的試劑取代現(xiàn)有試劑或混合現(xiàn)有試劑。 K 在混合或溶解蛋白溶液時，避免泡沫產(chǎn)生。 L 在實驗開始之，安排好實驗流程。 M 在實驗開始之，清潔工作臺。 N 若有問題，應(yīng)與我公司或代理商的技術(shù)支持聯(lián)系 結(jié)果判斷： 1. 每個標(biāo)準(zhǔn)品的OD值減去空白孔的OD值后作圖，如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值計算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。亦可以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2. 推薦使用業(yè)的曲線制作軟件，如curve expert 1.3或1.4，在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；亦可將樣品的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。 3. 若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。 會出現(xiàn)的問題及解決辦法： 1. 加入反應(yīng)終止液后，沒有吸光值或吸光值偏低。 a.原因：未加入酶標(biāo)記物。 解決辦法：請按照操作步驟進(jìn)行。 b.原因：試劑盒內(nèi)容物未能充分回。 解決辦法：確定試劑盒內(nèi)容物回溫后再進(jìn)行操作。 c.原因：室溫太低。 解決辦法：若室溫太低(<19℃)，請于操作步驟4，適當(dāng)延長溫育時間。 d.原因：未使用試劑盒的清洗液清洗。 解決辦法： 請用試劑盒內(nèi)所提供的清洗液清洗。 e.原因：試劑盒已過有效期限。 解決辦法：請更換成仍在有效期限內(nèi)的試劑盒。 2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性不佳，或是平行性不好。 a.原因：溫育位置避光不好或受到氣流干擾。 解決辦法： 請確認(rèn)溫育位置既不透光也不透風(fēng)(如抽屜內(nèi))。 b.原因：操作時間拖太久。 解決辦法：請在方法熟練后再進(jìn)行操作。 c.原因：微孔間相互污染。 解決辦法： 加樣品時，請小心勿濺出微孔外，以免造成其它微孔的污染。 d.原因：標(biāo)準(zhǔn)品或酶標(biāo)記物所加入的量不一致。 解決辦法：請使用已校正過的移液槍，并確保其與吸頭之間有高度密合性。 e.原因：添加樣品或試劑的操作方法不正確。 解決辦法：加樣品或試劑時，吸頭請勿接觸微孔。 f.原因：洗板過程發(fā)生問題(如管路堵塞、洗完板后未立刻進(jìn)行下一步驟)。 解決辦法：請隨時監(jiān)控洗板機(jī)洗板過程，洗完后立即進(jìn)行下一步驟。 3. 吸光值均偏高(或線性不夠陡)。 a.原因：室溫太高(>25℃)。 解決辦法： 若無法降低室內(nèi)溫度，請適當(dāng)縮短步驟4的溫育時間。 b.原因：底物溶液受到污染。 解決辦法： 若發(fā)現(xiàn)底物溶液已呈現(xiàn)淡藍(lán)色，請不要再使用。 c.原因：反應(yīng)時間超過太久。 解決辦法：請控制反應(yīng)時間。 d.原因：酶標(biāo)記物污染了盒內(nèi)其它試劑。 解決辦法：使用過的吸頭應(yīng)立即丟棄，可避免試劑間相互污染，凡是試劑(特別是酶標(biāo)記物與底物溶液)接觸過的容器應(yīng)立即清洗干凈。(先以漂白水浸泡，再以清水沖洗干凈，可確保無殘留) 4. 陰性標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值低于陽性標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值。 a.原因：微孔中的試劑未能充分混合。 解決辦法： 試劑加完后，需輕敲盤四周使其充分混合均勻。 b.原因：洗板過程發(fā)生問題(同2-f.)。 解決辦法：請參考2-f. c.原因：添加樣品或酶標(biāo)記物的量不一致。 解決辦法： 請參考2-d.